壳寡糖及其衍生物对实验性糖尿病大鼠调节血脂和抗氧化作用
(中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003)山东大学学报(理学版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
刘 冰，刘万顺 ，韩宝芹，陈列欢，王 萍
摘要：研究了不同剂量的壳寡糖，N．乙酰氨基单糖对STZ诱导的糖尿病大鼠的调节血脂和抗氧化作用．按65mg／k一次性腹腔内注射(ip)S3E制备糖尿病大鼠模型，随机分成糖尿病治疗组和糖尿病对照组．治疗组分别用壳寡糖、N．乙酰氨基单糖水溶液按每日250mg／kg，500mg／kg，l 500mg／kg灌胃，正常对照组，阴性对照组按体重灌胃等体积蒸馏水(10mL／kg)，阳性对照组按每日200mg／kg灌胃二甲双胍水溶液，连续60 d．对DM大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛浓度以及总抗氧化能力及甘油三酯、总胆固醇、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、载脂
A1／载脂B等指标进行测定．研究结果表明不同剂量的壳寡糖和N．乙酰氨基单糖均能不同程度地改善糖尿病大鼠的体重减轻、多饮、多食等症状．壳寡糖各剂量组对总抗氧化能力、SOD活力均有显著改善，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)，且剂量越高总抗氧化能力越强，MDA浓度越小，但SOD活力降低．壳寡糖组甘油三酯与正常组浓度无显著差异，胆固醇浓度轻度升高，我脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组降低，中荆量组有显著差异(P<0．050)，各剂量组载脂A1／载脂B值与阴性对照组比较有显著差异，中剂量组效果最好；N．乙酰氨基单糖各剂量组对抗氧化能力的改善效果与阴性对照组比较均无显著差异(P>0．050)，中、低剂量组SOD活力显著升高，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)，且剂量越低总抗氧化能力越强，MDA浓度越小，SOD活力增加．N．乙酰氨基单糖各剂量组甘油三酯，载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组较低，载脂A1／载脂B值降低与阴性对照组比较均有极显著差异(P<0．01)，低剂量组效果最好．不同剂量的壳寡糖和N．乙酰氨基单糖均能不同程度地调节糖尿病大鼠血脂和提高其机体抗氧化能力，壳寡糖中、高剂量组与N．乙酰氨基单糖低卉】量组效果较好．
关键词：壳寡糖；N．乙酰氨基单糖；糖尿病大鼠；血脂调节；抗氧化
中图分类号：R931．71 文献标识码：A
Effect of chitooligosaccharides and its derivatives on regulating plasmalipid and improving antioxidant ability in diabetic mouse induced by STZLIU Bing，LIU Wan—shun ，HAN Bao—qin，CHEN Lie—huan and WANG Ping(Colege ofMarine Life Science，Ocean University of China，Qingdao 266003，Shandong，China)Abstract：The efect of ehitooligosaeeharides and N-aeetyl~ueosamine of diferent dosage on regulating plasma lipid and improv．ing antioxidant ability in diabetic mouse induced by STZ were studied． The diabetic model of Wistar rats was duplicated with SIZonce intraperitoneally(65 mg／kg)，and then divided into diabetes treating groups and diabetes control groups randomLy．The dia．betes treating groups were administered(ig)chitooligosaeeharides at dose of 250 mg／kg，500 mg／kg，1 500 mg／kg daily for succes．sive 60 d．The normal control group and diabetes control group were received the equal volume of distilled water(10 ndJkg)．Met．fonnin treating group Was administered(ig)metformin at a dose of 200 mg／kg daily．The activitv of GPH．PX，SOD，capabilitv ofT-AOC，content of MDA， l℃ ，TC，ApoA，ApoB and A／B in plasma of DM mouse induced bv SIZ were measured after 60 davsfeeding study、All dose of chitooligosaccharides and that of N．acetyl ducosamine have efective efects on the general clinical
收稿日期：2005．06．14
基金项目：国家“十五”科技攻关资助项目(2001BAT08BIM．07)
作者简介：刘冰(1980． )，男，博士研究生，研究方向：生物化学
壳寡糖及其衍生物对实验性糖尿病大鼠调节血脂和抗氧化作用 159
symptom of DM rats．All dose of chitooligosaccharides improve the capability of T—AOC and activity of SODdecrease the content of MDA drastically，and have significant diffeFence(P<0．001)compared with DMgroup．With the increase of dosage of chitooligosaccharides，the capability of T-AOC increases，and content of
MDA and activity of SOD decrease accordingly．Chitooligosaccharides of all dose decrease the level of TG，ApoB and A／B，and have sign ificant difference in comparison with DM group．Middle dosage chitooligosac—charides have the best effect．N—acetyl glucosamine of all dose has no obvious efects on improving the capa—bility of T-AOC．Middle and low dosage N—acetyl glucosanline improves the activity of SOD，decreases thecontent of MDA drastically，and has significant difference(P<0．001)when compared with DM group．Withthe increase of dosage of N-acetyl glucosamine，the capability of T-AOC and activity of SOD decrease，whilethe content of MDA increased accordingly．N—acetyl glucosamine of all dose decreases the level of TG，ApoBand A／B，an d has significant difference when compared with DM group．Low dosage N—acetyl glucosamine hasthe best effect．In conclusion，chitooligosaccharides and N—acetylglucosamine of different dosage have differenteffects on regulating plasma lipid and improving antioxidant ability in diabetic mouse induced by STZ．Highand middle dosage of chitooligosaccharides and low dosage of N—acetyl glucosamine are the most effective．Key words：chitooligosaccharides；N-acetyl glucosamine；DM mouse；regulating plasma lipid；antioxidantability
0 引言
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌代谢病¨ ，具有遗传倾向，是由于胰岛素绝对或相对不足所致的血糖及尿糖增高为主要特征的，并导致糖、蛋白和脂肪代谢障碍全身慢性代谢异常综合症，常伴发心脑血管、肾、眼及神经等多种并发症，危害性大．据gNO报告，糖尿病已成为世界上继恶性肿瘤、心脑血管病后第3位严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病 ．糖尿病(DM)患者糖代谢的异常往往伴随着脂代谢异常，糖尿病患者患动脉粥样硬化疾病明显高于非糖尿病患者．DM发生冠心病死亡及严重的非致死性冠心病事件的危险性明显高于非糖尿病患者，且DM患者比非糖尿病患者更易患动脉硬化性疾病的原因，除了DM状态本身如高血糖、肥胖、高血压、高胰岛素血症、胰岛素抵抗等因素外，DM所致的脂代谢异常也是一个明确而重要的因素．近年来，关于临床糖尿病人或实验性糖尿病动物体内氧自由基反应增强、活性氧蓄积和氧应激反应增加的报道越来越多，自由基与糖尿病的关系13益引起人们的注意，自由基诱导的生化反应在糖尿病的发生发展过程中起重要作用．糖尿病发病与自由基损害的关系已在部分学者的工作中得到证实 ，早期糖尿病患者体内，全膜抗氧化状态(TAS)明显降低，提示糖尿病早期患者除了免疫、代谢方面的变化外，人体抗氧化防御系统功能也全面下降．壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)是壳聚糖的降解产物，分子量小，溶于水，可被人体、动物及植物机体吸收利用．研究发现，壳寡糖不仅具有和壳聚糖一些相似的性质，而且一些生理活性或功能性质更加显著 .，如提高机体免疫力¨ 、抗肿瘤作用 、调节血脂 、抗感染、防治病原生物感染、作为植物调节物质、作为促进双歧杆菌生长因子等．其降血糖作用国内已有报道l】 ．近来，国内外报道已经证实，壳寡糖在体外具有清除超氧阴离子自由基 。 、清除羟自由基 j、降低MDA的浓度的作用 j，从而可以有效地改善体内的自由基代谢紊乱．但以往研究一般用雌雄各半的KM小鼠作为研究对象，使其自由饮用壳寡糖水溶液，受小鼠体质、采血量和内分泌的影响，往往试验不系统，试验期较短，准确度低，且尚无从整体的角度研究壳寡糖对改善糖尿病脂代谢和自由基代谢紊乱作用的报道．本文从这个角度对不同剂量的壳寡糖及其衍生物N．乙酰氨基单糖调节STZ诱导的糖尿病大鼠的血脂作用及其改善大鼠体内自由基代谢紊乱关系进行了初步探讨．
1 材料与方法
1．1 实验动物
封闭群纯系雄性Wistar大鼠6O只(二级标准体重(200±20)g，月龄1—2个月，购买于青岛市立医院动物试验中心，稳定饲养1周．
1．2 实验试剂及仪器
壳寡糖，本实验室制备，数均分子量2 200；N．乙酰氨基单糖，本实验室制备，分子量221；盐酸二甲双胍(北京中会药业，批号H19983069)；链脲佐菌素(STZ)(SIGMA)；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、血清丙二醛试剂盒、总抗氧化能力试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TU．1800紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；Olym．pus血液生化全自动分析仪(Japan Olympus company)．
1．3 实验方法
1．3．1 模型制作
所有大鼠夜间禁食12 11，自由饮水，临用SrlZ前，将链脲菌素(1 200 rag)溶于60 HlL无菌0．1 mol／L柠檬酸钠缓冲液中( =4．2)，制成2％的链脲菌素溶液，大鼠称重并按65 mg／kg一次性腹腔内注射(ip)STZ．正常对照组注射等量的柠檬酸缓冲液．注射7 d后，眼眶静脉丛采血检测餐后2 h血糖(2hPG)，定性尿糖．尿糖在+++以上，血糖>11．11mmol／L，有多食、多饮、多尿症状者为成模标准．
1．3．2 动物分组及受试物剂量成模大鼠随机分为9组，每组9只：正常对照组(Normal contro1)，阳性对照组(Met)，阴性对照组DM)，壳寡糖组(COS)(高、中、低剂量)，N．乙酰氨
基单糖(NAG)(高、中、低剂量)；正常对照组、阴性对照组：按体重每日蒸馏水灌胃(10mL／kg)；二甲双胍阳性对照组：按每日1．2 g／6o kg的剂量放大1O倍给大鼠灌胃，即200 mg／kg；壳寡糖、N．乙酰氨基单糖组：分别按人推荐剂量(3g／6o kg)的5倍，l0倍，30倍每日称体重灌胃，即250 mg／kg，500 mg／kg，1 500mg／kg．连续给予受试物60天．
1．3．3 观察指标
1．3．3．1 一般状态观察每天观察各组大白鼠的一般健康状况、采食、饮水以及是否有异常．每天定时称重灌胃，根据体重调整灌胃量．记录体重，饮水量，食量．
1．3．3。2 抗氧化指标的测定60 d后，夜间禁食12 h，自由饮水，经大鼠腹主动脉采血，离心分离血清，试剂盒法测定血清谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、总抗氧化能力．
1．3．3．3 血脂测定
自动血液生化分析仪测定同一批血样中的甘油三酯(TG)、 凸P2~L日I-H固醇(CHO)、载脂蛋白AI(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂A1／载脂B(A／B)．
1．4 统计分析
全部资料用均数±标准差(X±S)表示，采用SPSS 1 1．0软件Independent．Samples T Test过程进行两样本均数差别的比较，One．Way ANOVA过程进行多组样本均数的比较，组问比较采用Duncan’S法，显著性界值分别设定为0．05，0．01，0．001．
2 结果和讨论
2．1 一般状态观察STZ注射后72 h，糖尿病大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、搔痒，毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少等特征，随着病程的进展，有些大鼠在病程1个月后出现白内障．不同剂量的壳寡糖对STZ诱导的糖尿病大鼠的一般状态都有明显的改善，可以显著地改善糖尿病大鼠体重减轻、多饮、多食等症状，中、高剂量组的效果要优于低剂量组．N 乙酰氨基单糖可以在一定程度上改善糖尿病大鼠体重减轻、多饮、多食等症状．二甲双胍组对降低糖尿病大鼠体重减轻，
多饮，多食等症状作用不佳．
2。2 壳寡糖，N．乙酰氨基单糖对DM 大鼠抗氧化能力的影响壳寡糖，N．乙酰氨基单糖对DM大鼠抗氧化能力的影响见表1．由表1可知阴性对照组总抗氧化能力，SOD活力显著下降，MDA浓度显著上升，与正常组比较均有极其显著差异(P<0．001)；壳寡糖各剂量组对总抗氧化能力，,SOD活力均有显著改善，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)，且剂量越高总抗氧化能力越强，MDA浓度越小，但SOD活力降低；N一乙酰氨基单糖各剂量组对总抗氧化能力的改善效果与阴性对照组比较均无显著差异(P>0。05)，中，低剂量组SOD活力显著升高，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)，且剂量越低总抗氧化能力越强，MDA浓度越小，SOD活力增加；二甲双胍组对总抗氧化能力有一定作用，与阴性对照组比较均有显著差异(P<0．05)，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)，SOD活力有一定提高但无显著差异．各组GPH．PX的活力无显著差异，与正常组比较P>0．05．
2．3 血脂指标的测定
血脂指标的测定见表2．由表2可知阴性对照组甘油三酯，载脂蛋白B质量浓度升高，与正常组壳寡糖及其衍生物对实验性糖尿病大鼠调节血脂和抗氧化作用 161比较有极显著差异(P<0．01)，载脂A1／载脂B值降低与正常组比较有极显著差异(P<0．01)，胆固醇浓度轻度升高．壳寡糖组甘油三酯与正常组浓度无显著差异，胆固醇浓度轻度升高，载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组降低，中剂量组有显著差异(P<0．05)，各剂量组载脂A1／载脂B值与阴性对照组比较有显著差异，中剂量组效果最好；N．乙酰氨基单糖各剂量组甘油三酯，载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组较低，载脂A1／载脂B值降低与阴性对照组比较均有极显著差异(P<0．01)，低剂量组效果最好；二甲双胍组甘油三酯，载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组较低，其中载脂蛋白B质量浓度和载脂A1／载脂B值与阴性对照组比较有显著差异．
表l 壳寡糖，N-L酰氨基单糖对DM大鼠60 d后抗氧化能力的影响(n=9，X±S)
Tab．1 Efect of COS，NAG on changes of SeIUlTI T-AOC，SOD，GPH—PX，MDA after 60 days feedingin normal control and STZ—induced diabetic rots(n=9，X±S)
Compared with DM group： P<0．05；一P<0．01；. P<0．001；Compared with Control group： P<0．05； P<0．01： P<0．001
表2 壳寡糖，N．乙酰氨基单糖对DM大鼠60 d后甘油三酯、总胆固醇、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、
载脂All载脂B的影响(n=9，X±S)Tab．2 Ef ect of COS，NAG on Changes of1V．，TC，ApoA，ApoB in st~ruln after 60 days feeding studyin normal control and STZ-induced diabetic rats(n=9，X±S)Compared with DM group： P <0．05；一P <0． 01；. P <0．001；Compared with Control group： P<0．05； P <0．01： P <0001
3 小结
3．1 壳寡糖及N．乙酰氨基单糖改善糖尿病大鼠体内自由基代谢紊乱的作用
本课题研究表明，不同剂量的壳寡糖对STZ诱导的糖尿病大鼠的一般状态都有明显的改善，可以
显著地改善糖尿病大鼠体重减轻、多饮、多食等症状，说明了壳寡糖能够有效地降低STZ诱导的糖尿
病大鼠的血糖值，改善其机体对葡萄糖的代谢能力，中剂量组效果较好．N．乙酰氨基单糖可以在一定程度上改善糖尿病大鼠体重减轻、多饮、多食等症状，低剂量组效果较好．而且STZ诱导的糖尿病大鼠，总的抗氧化能力下降，血液中SOD水平降低，脂质过氧化产物MDA浓度升高，与国内外学者报告相吻合 1驯．郑小丽等 的研究表明，总的抗氧化能力下降应该主要是抗超氧阴离子自由基的能力下降，对应的应是SOD酶的活力下降，我们的研究也证实了这一点，阴性对照组总的抗氧化能力下降，SOD酶的活力下降，而GPH．PX的活力在正常组和模型组间无显著差异(P>0．05)，可能因为GSH．PX的活性中心是硒半胱氨酸，硒(Se)是GSH．PX的必须部分，每1 tool酶含127 tool原子硒．所以GSH—PX的活力要和机体硒水平相关．壳寡糖能够改善糖尿病大鼠体内的抗氧化水平
的可能原因有以下两点：
第一，壳寡糖分子中存在还原端羰基和伯、仲一OH，一NH2，可与·02一发生反应，清
除掉·02一．而且壳寡糖对·01一的清除效果要好于壳聚糖，这可能是由于高分子量壳聚糖的分子链互相缠结，且分子内存在大量氢键，使得壳聚糖分子中活性官能团与·()'一作用机会降低，从而反应活性较低；降解后壳寡糖活性官能团暴露，易与·()2一充分作用，故对·0，一的清除活性明显提高；并且降低了·()，一对SOD的消耗，使得SOD活力显著升高．
第二，壳寡糖可以显著降低血糖，改善糖耐量，一方面减少高血糖状态下，因葡萄糖的自身氧化而形成的自由基数量，另外还减轻了葡萄糖与SOD、CAT的糖基化作用，促进SOD，CAT活力的增高，从而改善了糖尿病大鼠的自由基代谢紊乱．但壳寡糖组总的抗氧化能力剂量越高效果越好．而SOD活力却与之相反，剂量越低活力越高．可能因为SOD可被过高的自由基或过氧化物浓度刺激而代偿性地浓度增高或活性增强，以抵御组织氧化 J．血糖的降低可以减少高血糖状态下，因葡萄糖的自身氧化而形成的自由基数量，减轻了蛋白糖基化作用，促进SOD，CAT活力的增高，从而改善了糖尿病大鼠的自由基代谢紊乱．N一乙酰氨基单糖各剂量组对总抗氧化能力的改善效果与阴性对照组比较均无显著差异(P>0．05)，中、低剂量组SOD活力显著升高，MDA浓度与阴性对照组比较均有极其显著差异(P<0．001)．与壳寡糖组相反，N一乙酰氨基单糖剂量越低总抗氧化能力越强，MDA浓度越小，SOD活力增加，推测其对DM大鼠机体抗氧化能力的提高，可能主要在于降低血糖，从而减少高血糖状态下，因葡萄糖的自身氧化而形成的自由基数量，降低了内源性SOD、CAT、GSH—PX的消耗，同时减轻了蛋白糖基化作用，促进SOD、CAT活力的增高，从而改善了糖尿病鼠的自由基代谢紊乱．二甲双胍组对总抗氧化能力的改善效果不明显，其SOD活力升高，MDA浓度降低，可
能主要与其降血糖作用、减轻蛋白糖基化反应有关．
3．2 壳寡糖及N．乙酰氨基单糖改善糖尿病大鼠体内脂代谢紊乱的作用
目前，关于壳聚糖在调节血脂、降胆固醇方面的功能已有很多报道 j．壳寡糖是壳聚糖的降解产
物，是一种小分子，溶于水，可被人体、动物及植物机体吸收利用的物质．研究发现，壳寡糖不仅具有和壳聚糖一些相似的性质，而且一些生理活性或功能性质更加显著．本课题的研究表明壳寡糖可以降低甘油三酯的浓度，载脂蛋白B质量浓度，升高载脂A1／载脂B值且有显著差异，但对胆固醇和载脂Al的质量浓度无明显变化，提示壳寡糖的调节血脂机理可能与壳聚糖有所不同，主要是通过降低载脂蛋白B的质量浓度来实现的，中剂量组效果最好，可以显著性降低载脂蛋白B质量浓度(P<0．05)，载脂A1／载脂B值与阴性对照组比较有极显著差异(P<0．01)．壳寡糖能够调节糖尿病大鼠血脂的机理有以下3点：
第一，壳聚糖乙酰残基上带正电，在酸性环境中，与带负电的分子(如脂肪)结合，可阻止消化系统
吸收TG和TC．
第二，正电性的壳聚糖还可与负电性的胆汁酸结合而使其排出体外，从而打断了胆汁
酸的肠肝循环，破坏了胆固醇在胆盐作用下形成的紧密结合微胶粒，阻止胆固醇进入肠粘膜细胞，降低了胆固醇的吸收．
第三，壳聚糖还可以促使胆固醇在肝脏内转化，壳聚糖与胆汁酸结合并排出体外后，了保持胆囊中有一定的储量，胆固醇在肝脏中加速转化生成胆汁酸，从而大大减少了进入血管的胆固醇量．壳聚糖将过剩的胆固醇调节成适当值的优异功能，发挥着防治心、脑血管疾病的重要作用．N一乙酰氨基单糖各剂量组甘油三酯，载脂蛋白B质量浓度相对阴性对照组较低，载脂A1／载脂B值与阴性对照组比较有显著差异，说明其调节血脂的机理也是通过降低载脂蛋白B的质量浓度来实现的，低剂量组效果较好．
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