壳寡糖对肿瘤抑制作用实验研究
                             黑龙江省齐齐哈尔医学院免疫学教研室(161041) 官 杰李殿俊 傅振坤

提要 目的观察壳寡糖对肿瘤抑制作用的影响。方法采用体内注射的方法将壳寡糖注人荷瘤小鼠腹腔及瘤内，观察肿瘤生长情况及NTT比色法观察壳寡糖对肿瘤细胞的体外作用。结果壳寡糖对荷瘤小鼠肿瘤的生长有抑制作用，显微镜观察显示肿瘤组织出现坏死；壳寡糖对肿瘤细胞生长有抑制作用，其抑瘤率与浓度有关，与时间无关，细胞经壳寡糖作用后，透射电镜显示细胞有凋亡趋势。结论壳寡糖可抑制肿瘤生长，同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。
关键词壳寡糖肿瘤抑制
Stlay蚰InhAhlb Elnteet ofCllitlma 0Ii窖【融cdm咖e蛐-I、m啪r． CuanJ／e，L／ 咖，FuZhenkun． ofImmuno／ogy，Qi神Med／ca／Co／／ege W 胁 昭161042， China
Abslraet Objective To observetheinhibilion efect of ehitlsan oligosaceharide OntlumolllF．Methods The growth oftlumolllFwere oh6ervedafter ehitlJ~ oligo6aeeharide wa8 injected into abdominal cavity (ip)01"introtumour of mice；And the anti proliferation activities of chid酗IrIoligo~aceharide on cells W~l"e evaluated by lllealllS of NIT assay．Results Growth of tumour'were inhibited by ehitlsan oligosaeeharide，nec~ Lwas observed in the lllmOlll"tissue．Chitlsan oligosaceharide afected the growth of cel1．The efect waft related to concentration of ehitlsan oligo~ac．eharide．but not depending of culturetime．The apoptosis ofcell8 could be seen underthetransmission electron．Condusion Chitlsan oligo~ ．eharidecould inhibit the growth of tumour and might induce apoptosis of cel1．
word Chitlsan oligosaceharide；Tumour；Inhibition
壳寡糖为壳聚糖的降解物。壳聚糖是甲壳质(几丁质)的脱N一乙酰基化物，甲壳质是N乙酰基
一D一葡萄糖胺以口一1．4键结合而成的多糖，作为虾、蟹等甲壳类、甲虫等的外骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁成分，广泛存在于自然界的天然高分子物质。甲壳质和壳聚糖具有广泛的生物学作用，如在医药、食品、化妆品、化工、环保及农业方面有广泛的用途? ，特别是具有提高机体的免疫功能、抗肿瘤、抗感染等作用l2]。但由于它们不溶于水，其开发利用受到了很大程度的限制，而壳寡糖为壳聚糖的降
1．哈尔滨医科大学免疫学教研室(150086)· 2O ·解物，具有良好的水溶性，易被分散和吸收，而且具有多种生物功能，如作为植物功能调节剂，刺激植物生长l3J，增强植物对病虫害的防御能力。改善肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长[制，同时它能提高机体的免疫功能和抗癌能【引。
材料与方法
1．材料：(1)实验对象：昆明小鼠(哈尔滨医科大学第三临床医院提供)，H一22人肝癌细胞(哈尔滨医科大学免疫教研室提供)，LH一7人肺癌细胞(哈尔滨医科大学免疫跚窀提供)。(2)药品与试剂：壳寡糖(哈尔滨工业大学提供)，小牛血清，164o培养液， 四甲基偶氮唑盐(MTr)，二甲基亚砜(DMSO)。(3)仪器与器材：倒置显微镜，酶标96孔培养板，超净工作台，二氧化碳孵箱等。
2．方法
(1)体内实验：将6o只昆明小鼠随机分为两大组。①移植性腹水瘤组(抗瘤组)：3O只小鼠随机分为3组，每组lO只。分别为壳寡糖小浓度组(O．5％)；壳寡糖大浓度组(1．5％)；对照组(生理盐水)。试验第1天，各组小鼠腹腔种植I-i22肝癌细胞(1 X 108／m1)，以后每天向各组小鼠腹腔
注射O．2ml的药物或生理盐水。7天后小鼠脱颈处死，无菌取腹水，据腹水量计算抑瘤率，并作病理涂片，观察瘤细胞病理变化；②移植性实体瘤组(抑瘤组)：分组方法同① 。试验第1天一第7天各组小鼠腹腔注射药物或生理盐水O．2ml，第8天各组小鼠背部皮下种瘤，同时腹腔继续给药
至试验第14犬后，处死小鼠，剥瘤称重，计算抑瘤率。取实体瘤标本做病理观察。
(2)体外实验：①细胞培养：LH一7肺癌细胞培养于RPMI一1640培养液(含10％小牛血清)中，在含5％co：的37℃孵箱中培养。细胞呈现贴壁状态，每3犬传一代。实验用处于对数生长期的细胞；②MTr法：细胞以1×t04／ml，100btl接种于96孔培养板中。5％co：，37℃孵箱中稳定后，
加入壳寡糖8od，浓度为2000、1000、500、250、50mg／L，每组设空白埘照和对照。分别作用12、24、48、72h后加入5rag／m1的MTr~id，孵育4h后弃去．i-_清，加DMSOlS0bd，振荡均匀，在490nm酶标仪卜读OD值，并计算抑瘤率。细胞抑瘤率： (1一实验组OD值／对照组OD值)X 100％。将细胞用戊二醛固定，做电镜观察(对照组，壳寡糖250me／L，壳寡糖S00me／L，壳寡糖1000m~L)。 ，
3．统计学方法：资料采用t检验搜方差分析，应用SPSS10．0统计软件计算试验组搜对照组差异的显著性，P<O．05具有统计学意义。
结 果
1．体内实验：(1)移植性腹水瘤组(抗瘤组)：腹水量见表1，病理图片见图1～3。抑瘤率= (对
照组腹水量一实验组腹水量)／对照组腹水量X100％。(2)移植性实体瘤组(抑瘤组)抑瘤率：见
表2，病理图片见图4～6。抑瘤率= (对照组一实验组)／对照组X 100％
表1 壳寡糖对移植性腹水瘤重的影响
图1 对照组腹水病理图片
图2 壳寡糖大浓度组(1．5％)腹水病理图片 图3 壳寡糖小剂量组(O．5％)腹水病理图片
表2 壳寡糖对移植性实体瘤重的影响 2．体外实验：(1)M1Tr法结果见表3。抑瘤率= (1一实验组OD／对照组OD)X 100％。将以上各组结果在时间上进行统计学比较分析，应用t检验，
得出结果皆为P>O．05，说明壳寡糖对肿瘤细胞抑制与时问无关；随着浓度升高肿瘤细胞增生抑制率增高，但浓度达2000mg／I 时抑制率呈下降趋势。
(2)电镜观察结果见图7。细胞体积变小，表面微绒毛变成质膜叶片，部分细胞核变大，核分裂象减
少，髓样小体、线粒体减少，核周围出现丰富胞质丝；细胞无坏死，部分细胞核周围可见大量脂滴堆
积，体现细胞变性的形态特征瘤细胞周边和瘤细胞内有少量骨骼肌细胞，
瘤细胞中心有多处灶状坏死(10×40，H—E染色)
图_4 对照组瘤细胞形态学表现瘤细胞周边坏死向瘤内蔓延(10×40，H—E染色)
图5 壳寡糖(1．5％)组瘤细胞形态学表现瘤细胞中心坏死明显(10×40，H—E染色)
图6 壳寡糖(O．5％)瘤细胞形态学表现表3 不同浓度壳寡糖与肿瘤细胞共同培养后
不同时间细胞增生抑制率情况(％)· 22 ·染色质轻度边集核膜下，核周出现丰富高尔基体——细胞凋亡早期状态特点
图7 壳寡糖浓度为1咖0IIlg／L时瘤细胞电镜下形态变化(x 6000)
讨 论
本实验所用的壳寡糖具备水溶性好、生物活性高、功能作用大、应用领域广、易被人体吸收等突出特点，在医药、功能性食品、Et化、农业等领域应用广泛。1990年，Ouchi—T等研
究发现3个壳寡糖通过六亚甲基空间通道与5一氟尿嘧啶(5一FU)共轭结合后，其抗肿瘤作用强于5
一FU；并把该复合物注入 淋巴细胞白血病小鼠的腹腔中，小鼠的生存时间延长；通过皮下注射应
用于MeTH—A纤维肉瘤或MH134肝细胞癌小鼠，发现产生对肿瘤的生长抑制作用。而且此复合物还有以下优点：①不引起急性中毒；②不引起体重的迅速下降。另外，目前国内也有低分子壳多糖应用于肿瘤放疗患者检测其对免疫功能影响的报道。王中和等用低分子壳多糖口服液对临床患者进行辅助治疗，结果发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，T淋巴细胞的数量显著上升，说明低分子壳多糖能调整机体免疫功能，减少放疗对患者免疫功能的影响，有较好的抗肿瘤辅助疗效。而这些免疫指标的研究再一·次表明，其作用机制与细胞免疫密切相关。2002年，杜昱光证明壳寡糖对肿瘤细胞的抑制作用与浓度有关，且随浓度增加抑制率上升。本实验研究结果表明壳寡糖大浓度组对荷瘤小
鼠腹水瘤和实体瘤均有抑制作用，小浓度组抑制作用不明显。实体瘤组，小浓度和大浓度组均有细胞
坏死，但大浓度组坏死明显；体外细胞培养结果显示随着壳寡糖浓度升高细胞增生抑制率升高，但浓
度达2000mg／L时抑制率呈下降趋势，抑制率与作用时间无关，体外细胞培养电镜观察结果(1000me／L)显示细胞体积变小，表面微绒毛变成质膜叶片，部分细胞核变大，核分裂象减少，髓样小体、线粒体减少，核周围出现丰富胞质丝；细胞无坏死，部分细胞核周围可见大量脂滴堆积，体现细胞变性的形态特征染色质轻度边集核膜下，核周出现丰富高尔基体——细胞凋亡早期状态特点。因此，该实验结果为适当浓度的壳寡糖可抑制肿瘤生长，同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。
参考文献
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(收稿：2005一()8—31)