壳寡糖激活巨噬细胞的机制
韩艳萍 ，赵鲁杭 ，吴海明
(1．浙江大学医学院生物化学与分子生物学教研室，2．义乌市中医院外科)
[摘 要] 目的：探讨巨噬细胞结合、内吞壳寡糖以及壳寡糖激活巨噬细胞的机制。方法：利用荧光
物质2一氨基吖啶酮标记壳寡糖，在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞内吞壳寡糖的过程，流式细胞
仪分析细胞的荧光强度，通过竞争性抑制实验及钙离子、胰蛋白酶、秋水仙碱对内吞的影响来确定
巨噬细胞内吞壳寡糖的机制。通过RT—PCR方法检测TNF—a来反映结合及内吞过程对壳寡糖刺激
巨噬细胞的影响。结果：巨噬细胞可结合内吞壳寡糖。内吞易受温度影响，37 C较迅速(<2 rain)，
4 C只能结合不能内吞。EDTA可抑制巨噬细胞内吞壳寡糖；经胰蛋白酶预处理的巨噬细胞摄取壳
寡糖的能力大大降低，终止胰蛋白酶后巨噬细胞摄取壳寡糖的能力得到恢复。秋水仙碱预处理可明
显抑制巨噬细胞摄取壳寡糖，并呈剂量依赖性。0．1 mol／L甘露糖可抑制壳寡糖对巨噬细胞的刺激
作用。结论：甘露糖受体介导的吞饮是巨噬细胞内吞壳寡糖的一条重要途径，甘露糖受体在壳寡糖
激活巨噬细胞中起重要作用。
[关键词] 巨噬细胞；肿瘤坏死因子a；寡糖类／药理学；甘露糖；受体，细胞表面；胰蛋白酶／药理
学；秋水仙碱／药理学
[中图分类号] Q 53 [文献标识码] A [文章编号] 1008—9292(2006)03—0265—08
M echanism of oligochitosan—induced macrophage activation
HAN Yan—ping ，ZHAO Lu—hang ，WU Hai—ruing。(1．Department of Biochemistry and Molecular
Biology，College of Medicine，Zh~iang University，Hangzhou 310006，China； 2．Chinese
Traditional Medicine Hospital of Yiwu，Yiwu 322000，China)
[Abstract] Objective：To study the mechanism of oligochitosan—induced macrophage activation．
Methods：Oligochitosan was chemically modified with fluorophore 2-aminoacridone (2-AM AC)．
The cellular events of 2-AM AC—-oligochitosan——macrophage interaction were analyzed with
confocal laser microscopy and the fluorescence intensity of cells was analyzed by BD LSR flow
cytometer．The mechanism of oligochitosan uptake by macrophages was studied by competitive
inhibition test and the effect of calcium ，trypsin and colchicine on oligochitosan recognition and
internalization were also determined．RT—PCR was perform ed to investigate the level of TNF—d
收稿日期：2004—1O一25 修回日期：2006—03—21
基金项目：浙江省自然科学基金(302031)．
作者简介：韩艳萍(1978一)，女，硕士生．
通讯作者：赵鲁杭(1962一)，男，副教授，从事生物化学与分子生物学研究；E—mail：zhaoluhang@263．neti
维普资讯 http://www.cqvip.com
浙江大学学报(医学版) 第35卷
secretion．ReSuIts：M acrophage could bind and uptake oligochitosan，which was dependent on the
temperature：the uptake proceeded rapidly at 37 C and at 4 C maerophage could only bind
oligochitosan．EDTA decreased oligochitosan uptake．Trypsin treatment significantly reduced the
internalization。and uptake was recovered by trypsin termination．Colchicine significantly inhibited
the internalizarion process and was dose dependent． 0．1 mol／L mannose inhibited TNF—a
expression induced by oligochitosan．Conclusions：Macrophage could uptake oligochitosan via
mannose receptor mediated pinocytosis．Mannose receptor is crucial for the oligochitosan—induced
macrophages activation．
[Key words] Macrophages； Tumor necrosis factor—alpha； oligosaccharides／pharmacol；
Mannose~Receptors，cell surface；Trypsin／pharmacol；Colchicine／pharmacol
[J Zhejiang Univ(Medical Sci)，2006，35(3)：265—272．]
几丁质(N一乙酰氨基葡萄糖经f}-l，4一糖苷键连接形成的聚合物)及其部分脱乙酰化产物壳聚糖是自然界含量位居第二的多聚物，广泛分布于昆虫、甲壳类动物外骨骼，真菌细胞壁及某些绿藻中。壳寡糖可由壳聚糖经酶解或化学水解等方法制得，其成分为3～10个N一乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖，经B—l，4糖苷键连接而成的线性寡聚体。壳寡糖克服了几丁质、壳聚糖不溶于水的缺点，能很好地经肠道被人体吸收。除此之外，它还具有多种生物学功效，如增强免疫效应，抗肿瘤活性，抗细菌、真菌感染，促进伤口愈合等_1 ]。有研究表明，壳寡糖发挥生物学效应的机理与激活多种免疫效应细胞(如巨噬细胞、T细胞、NK细胞)，诱导多种细胞因子[如白细胞介素一l(IL一1)、白细胞介素一6(II 一6)、肿瘤坏死因子一a(TNF—a)]和促进活性氮、氧中间体的分泌有关l_6 ]。尽管壳寡糖已被证明可激活巨噬细胞这一重要免疫细胞，但它产生此效应的机制尚不明确。本研究主要探讨巨噬细胞结合、摄取壳寡糖的机制，以及巨噬细胞表面膜受体在壳寡糖激活巨噬细胞中的作用。
1 材料与方法
1．1 细胞的培养RAW264．7巨噬细胞(购于中科院上海生化所)在含有10 小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)RPMI—l640培养液(INVITROGEN公司)、100 U／ml青霉素与链霉素，37 C、5 CO 孵箱中培养。台盼蓝染色法计算细胞存活率达95 以上 细胞铲(OrangeScientific公司)刮除法传代，白细胞计数板计数，调整细胞浓度至l×10 ／ml。将200 l细胞悬液接种到盖玻片，3～4 h贴壁后用无血清RPMI一1640培养液冲洗3次，洗去未贴壁细胞，然后加入200 1无血清RPMI—l640培养液，
备用。
1．2 壳寡糖的制备采用复合纤维素酶解壳聚糖的方法lI 。HPLC分析制备的壳寡糖粗提物，其主要成分为壳六糖，质谱分析主要成分的分子量为985．4。
1．3 荧光物质2一氨基吖啶酮(2-AMAC)标记壳寡糖 改进Jackson[1 的2一氨基吖啶酮标记糖的方法。基本步骤为：5 l 20 mmol／L壳寡糖于0．5 ml Eppendorf管，离心、冷冻、干燥后，加入l0 t*l l00 mmol／L 2-AMAC(用3／l7冰乙酸一二甲亚砜溶解，中科院上海生化研究所王克夷
研究员馈赠)和100 l 1．0 mol／L硼氢氰化钠(NaBH。CN，用四氢呋喃溶解)，混匀、离心，置
于45 C 水浴反应5 h；取出，离心冷冻干燥，溶于400 ttl 50 二甲亚砜一水溶液中。另取l0 l
l00 mmol／L2一AMAC(用3／l7冰乙酸一二甲亚砜溶解)和100 ttl 1．0 mol／L硼氢氰化钠(用四
氢呋喃溶解)，混匀、离心，置于45 C水浴反应5h；取出，离心、冷冻、干燥，溶于400 ttl 50 二甲亚砜一水溶液中，作为实验的空白对照，以排除2-AMAC与巨噬细胞结合所带来的实验干扰。
1．4 激光共聚焦显微镜观察2-AMAC标记的壳寡糖激活巨噬细胞的机制壳寡糖与巨噬细胞的作用 实验前用PBS缓冲液冲洗预先接种在盖玻片上的巨噬细胞3遍后，分别加入不同浓度的2-AMAC(0．01、0．025、0．1 mmol／L)标记的壳寡糖或2-AMAC20 l，在暗处于37 C或4 C孵育特定时间，洗涤细胞，3．3 福尔马林固定10 min，封片，在激光共聚焦显微镜(激发波长为450 nm，发射波长520 nm)下观察。1．5 流式细胞仪分析2-AMAC标记的壳寡糖与巨噬细胞结合显示的荧光强度用刮除法将贴壁的巨噬细胞制成细胞悬液(溶于PBS缓冲液)，调整细胞浓度为1×10 ／ml。在经过EDTA、胰蛋白酶处理后，或在甘露糖、秋水仙碱的存在下与0．1 mmol 2-AMAC一壳寡糖避光
孵育特定时间，1 000 r／min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞3遍，细胞沉淀重新悬浮于
PBS中。结合了2-AMAC一壳寡糖的细胞的荧光强度用BD—LSR流式细胞仪的Cell Quest软件
检测。特异性结合的荧光通过总的荧光减去用100倍过量未标记的壳寡糖存在的条件下的荧
光而得到。1．6 RT—PCR检测巨噬细胞分泌TNF—a 细胞总RNA提取用Trizol(上海生工生物工程公司)，氯仿按说明书操作步骤提取。逆转录步骤：1l l RNA溶液加入1 g随机六聚引物，混匀，
离心数秒，70 C温育5 min，冰浴冷却，依次加入4 l 5×逆转录缓冲液、1 l RNasin(20 U)和2
l dNTP，混匀，短暂离心，25 C温育5 min；加入1 l Mo—MLV逆转录酶(200 U)，混匀，短暂
离心。总量为20 l的反应体系于25 C温育10min；42C反应1 h，70 C 10 min停止反应。PCR
反应条件：94 C预变性5 min，94 C 30 S，55 C 1min，72 C 1 min，扩增30个循环，72 C延伸10min。小鼠 actin正链引物序列：GAGACCTTCAACACCCCAGC，负链引物序列：GAACC
GCTCATTGCCAATAGTG。TNF—a正链引物序列：CCCAAATGGCCTCCCTCTC，负链引
物序歹0：CAAATCGGCTGACGGTGTG。
1．7 统计学处理所有数据以 ±S表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。设P％0．05为统计学上差异有显著性。
2 结 果
2．1 巨噬细胞对壳寡糖的结合与摄取 在激光共聚焦显微镜下观察到，2-AMAC一壳寡糖与
巨噬细胞结合并进入巨噬细胞(图1)。在37C条件下这个过程比较迅速，从结合到摄人时间<2
min，而且随着时间的延长，巨噬细胞摄取壳寡糖的量也逐渐增多，30 min达到饱和。1 min、
10 min、20 min、30 min、60 min的细胞荧光强度分别为3．86±1．33、18．45±1．75、31．54±2．99、47．61±5．79、48．18-I-5．86(图2)，经趋势性检验P％0．05。摄人的壳寡糖在巨噬细胞胞浆中弥散，一部分进入细胞核，并在核内集中，聚集于核仁的位置。巨噬细胞摄取壳寡糖易受温度的影响，在低温(4 C)条件下，巨噬细胞摄取壳寡糖的效率大大降低，结合量在60 min达到饱和。1 min、10 min、20 min、30 min、60 min、70 min的细胞荧光强度分别为0．83-I-0．21、2．75± 0．27、3．21-I-0．48、4．14± 0．75、6．18±1．46、6．17±1．65，经趋势性检验P<0．05。在激光共聚焦显微镜下观察，壳寡糖只结合在巨
噬细胞膜上，不进入胞质。若温度回升，巨噬细胞可在短时间内恢复摄取壳寡糖的能力(图2)。
温度回升2 min、5 min、10 min后的细胞荧光强度分别为14．1±3．39、18．3±3．02、20．72±5．13。作为对照的2-AMAC与巨噬细胞的结合量很少，很容易被PBS冲洗掉。
2．2 巨噬细胞膜表面甘露糖受体及循环甘露糖受体参与壳寡糖的摄人壳寡糖是由氨基葡萄糖和N一乙酰氨基葡萄糖组成的寡糖，因此很有可能被甘露糖受体识别结合。预先加入0．1mg／ml的甘露糖后巨噬细胞摄取2-AMAC一壳寡糖的荧光强度为29．50± 1．96，只加2一AMAC一壳寡糖组的荧光强度是43．89-I-5．27，两者经t检验P％0．05，说明甘露糖可抑制巨噬细胞摄取2-AMAC一壳寡糖，提示甘露糖受体可能参与了壳寡糖的内吞。为了进一步验证甘露糖受体的参与，本实验分别用EDTA和胰蛋白酶作用巨噬细胞，观测EDTA 和胰蛋白酶对壳寡糖摄入的影响(表1)
壳寡糖激活巨噬细胞的机制呈剂量依赖性，而吞噬抑制剂细胞松弛素D却只在高浓度时起到抑制作用，这与壳寡糖的分子大小(主要为六糖，分子量1 000左右)相符合，壳寡糖溶于水，能通过0．22 m滤膜，而巨噬细胞不能吞噬小于1 m 的颗粒物质。另外，巨噬细胞摄取壳寡糖是个迅速的过程，在小于2min的时间内即可完成，一般吞噬的过程则相对缓慢口 ，长达1 h，因此，壳寡糖不可能是通过吞噬进入巨噬细胞的。巨噬细胞通过甘露糖受体内吞多种外源性微生物及内源性配体的同时也诱导其发挥效应细胞的功能(释放活性氮氧化物和多种细胞因子)，增强巨噬细胞杀伤微生物和内吞配体的能力。研究表明甘露糖受体可能在此过程中起到信号传导的作用[1 。实验中发现0．1 mmol／
ml甘露糖可抑制壳寡糖刺激巨噬细胞产生TNF—a，说明甘露糖受体对壳寡糖的识别在壳寡糖激活巨噬细胞中起重要作用。而甘露糖自身刺激巨噬细胞产生TNF—a的能力很小。甘露糖受体介导的这种效应的机理较复杂，颗粒型配体与可溶性配体通过甘露糖受体活化巨噬细胞在不同条件下效应不同，这可能与巨噬细胞的功能状态、分化程度、配体的类型或巨噬细胞上其他凝集素与甘露糖受体的联合作用有关[1 。甘露糖受体结构有胞外区、跨膜区及胞浆区。胞外区有糖识别结构域(CRD)，其中
CRD4—8具备完整的甘露糖受体所具有的配体识别功能；跨膜区和胞浆区则与内吞配体及将受体定位于有衣小凹中起关键作用[1 。究竟是受体的哪一区域将识别、内吞配体和激活巨噬细胞功能联系起来，以及其间的分子机制目前尚无确切说法。除甘露糖受体之外，尚有报道CR3、CD14也可结合N一乙酰氨基葡萄糖及壳聚糖L8 ，这些受体是否在壳寡糖激活巨噬细胞中发挥作用以及如何发挥作用还有待于进一步研究。
实验中还观察到壳寡糖可进入细胞核，在胞核中呈现集中分布现象，聚集在核仁周围，不像在胞质的弥散分布。至于壳寡糖为何聚集于此目前尚不清楚，Wang等报道核内存在可结合糖复合物的凝集素[】 ，那么核仁区域是否也存在着可结合壳寡糖的凝集素?核仁在核糖体RNA合成中起重要作用，而核糖体的组装又与合成分泌性蛋白密切相关，研究表明分泌功能旺盛的细胞(如巨噬细胞、B细胞)的核仁组织区相对发达。壳寡糖聚集在核仁附近是否与其促进巨噬细胞分泌一系列细胞因子有关系?对于这些问题的进一步认识可深入揭示壳寡糖诸多生物学效应的机制。
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